Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Разработаны основные приемы предварительной обработки зернового сырья и проведена оценка биологической ценности получаемых субстратов с использованием в качестве микробного тест-объекта молочнокислых бактерий (МКБ) Lactobacillus paracasei. Известно, что гидролиз протеина повышает его биодоступность для лактобактерий и тем самым активность роста. Поэтому на следующем этапе суспензии муки подвергали обработке протеолитическим препаратом Protex 40E («Genencor»). После 48 ч ферментации титр лактобактерий на средах с пшеничной, гречневой и гороховой мукой увеличился до 2,4×10^9, 2,5×10^8, 1,7×10^9 КОЕ/мл, соответственно, а на среде с ржаной мукой не изменился. Для повышения биодоступности углеводов и увеличения выхода молочной кислоты проводили гидролиз субстратов амилолитическим препаратом Duozyme («Novozymes») с последующей обработкой Protex 40E («Genencor»). После 48 ч ферментации титр лактобактерий от 8,0×10^8 до 1,0×10^9 КОЕ/мл составлял на всех средах. Наиболее высокие выходы лактата 88% и 89% от потребленных редуцирующих веществ были характерны для сред с ржаной и гречневой мукой, соответственно. На пшеничной муке выход молочной кислоты был несколько ниже (54%). При этом степень потребления редуцирующих веществ не превысила 51%, что предположительно, связано с достижением лимитирующего для биосинтеза значения pH. На следующем этапе для устранения этого фактора культивирование лактобактерий проводили в условиях поддержания pH в биореакторе. Исходя из результатов предыдущих экспериментов, наиболее благоприятным субстратом являлась ржаная мука, однако выход редуцирующих веществ (субстрата для синтеза молочной кислоты) с единицы массы пшеничной муки после гидролиза был выше, а активности роста лактобактерий были сопоставимы. Ферментацию проводили на гидролизате пшеничной муки с отделением после гидролиза твердой фазы в мембранном биореакторе. На первом этапе получали суспензию клеток высокой концентрации в среде обработанной протеазами. После 24 ч роста биосуспензию концентрировали в 6 раз и вносили гидролизат пшеничной муки, полученный при обработке амилазами и протеазами. В результате выход молочной кислоты составлял 112% от потребленных РВ, степень потребления РВ приблизительно 100%, а титр лактобактерий 3,5×10^9 КОЕ/мл. Исследован рост галобактерий на ферментолизатах крупы и муки различных видов зерна. Преимуществом данного подхода является использование растительного сырья не только в качестве носителя для иммобилизации (адгезии) клеток, но и для полного удовлетворения потребностей микроорганизмов в азотном питании, что показано впервые. Наилучшей результаты по накоплению биомассы и содержанию в ней бактериоруберина (до 12 мг/ 100 г АСБ), характеризующего функциональные свойства продукта, получены при глубинном культивировании на протеолизатах кукурузной и ячневой муки. Проведена оценка различных типов побочных продуктов переработки растительного сырья (пшеничных отрубей, шелухи и шрота подсолнечника, послеэкстракционного шрота кофейных зерен), а также нетрадиционного растительного сырья (клубней топинамбура) в качестве основного компонента питательных сред для глубинной ферментации дрожжей Rhodothorula rubra, способных синтезировать каротиноиды. Среди каротиноидов исследуемого штамма преобладают β-каротин,торулин и торулародин. Для анализа содержания каротиноидов в биомассе дрожжей их экстрагировали петролейным эфиром и определяли концентрацию упомянутых веществ спектрофотометрически. В результате переработки растительного сырья побочные продукты обогащаются малоусвояемыми дрожжами компонентами клетчатки, поэтому они были подвергнуты предварительной обработке ферментами с целлюлазной (Cellic CTec2, Novozyme) и гемицеллюлазной (Cellic HTec2, Novozyme) активностью, комплексным препаратом Viscoferm (Novozyme). В качестве альтернативного метода предварительной обработки был изучен гидролиз разбавленной серной кислотой. Фруктаны топинамбура метаболизировались дрожжами без дополнительного гидролиза. Гидромодуль составлял 12 для топинамбура и 10 для остальных видов сырья. Максимальный выход РВ и общих углеводов был получен после кислотного гидролиза топинамбура – 52,3 и 65,4 г/л, соответственно. Глубинную аэробную ферментацию дрожжей проводили в качалочных колбах при температуре 30 °С и перемешивании (150 об/мин). Содержание клеток продуцента определяли путем прямого подсчета. Конечные концентрации дрожжей при культивировании на водном экстракте клубней топинамбура составляла 14,8 г/л, а в остальных случаях не превышала 10 г/л. С другой стороны, в биомассе после кислотного гидролиза клубней накопление каротиноидов составляло 44,2 мкг/г, что соответствует 282,6 мкг/л культуральной жидкости. Несмотря на то, что содержание каротиноидов в дрожжах, полученных на водном экстракте топинамбура, была значительно ниже, благодаря высокому содержанию клеток, концентрация каротиноидов в КЖ была 278,2 г/л. Провели оптимизацию условий предварительной обработки клубней топинамбура с использованием ЦКРП. Для рН, температуры и продолжительности гидролиза были выбраны следующие значения: нулевой уровень – 2,5, 120,0 °С и 25 мин., интервал варьирования для ПФЭ – 1,25, 6 °С и 10 мин. Звездное плечо для 3 независимых параметров – 1,682. Получены функции отклика для выхода РВ, конечного содержания дрожжей и концентрации каротиноидов. Исследованы и оптимизированы условия гидролиза клубней с учетом выхода РВ. Построена регрессионная зависимость. Оптимальными параметрами процесса гидролиза для максимального выхода РВ являются рН 1,24, температура 110,6 °С, продолжительность гидролиза 25 мин, а для максимальной конечной концентрации каротиноидов - рН 1,59 и температура 107,0 °С, либо рН 3,41 и температура 114,0 °С при продолжительности гидролиза 25 мин. Расчетная концентрация каротиноидов в культуральной жидкости составляет для обоих вариантов 392 мкг/л, что также было подтверждено экспериментальными данными.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Пробиотические культуры являются одним из наиболее востребованных компонентов функциональных продуктов питания. Однако применение традиционных компонентов сред для ферментации бифидо- и лактобактерий является значительным сдерживающим экономическим фактором. К тому же животное сырье, которое преимущественно используется для производства указанных компонентов, не является возобновляемым. В рамках нашей работы был раскрыт высокий потенциал зернового сырья, в частности, пшеницы для частичной или полной замены питательных веществ при ферментации пробиотических микроорганизмов. Впервые показано, что гидролизаты пшеницы без внесения дополнительных компонентов обладают аналогичными ростовыми характеристиками по сравнению с дорогостоящей и традиционно используемой для культивирования лактобактерий среды МРС. Оптимизированы условия предварительного ферментативного гидролиза, благодаря чему полученная после ферментации суспензия содержала 2,3 млрд. КОЕ пробиотических бактерий L. rhamnosus в 1 мл. При этом денежные затраты на сырье для получения питательной среды сокращаются в несколько раз. Полученный гидролизат был благоприятной средой для культивирования других пробиотических штаммов, в частности, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus helveticus. Гораздо более требовательными к составу ростовой среды являются бифидобактерии. В данном случае оптимизацию условий предварительного гидролиза провели с ферментным препаратом панкреатин, а полученный ферментолизат являлся единственным источником веществ пептидной природы. Полученная после культивирования бифидобактерий пробиотического штамма B. adolescentis биосуспензия содержала до 50 млн. КОЕ в 1 мл. Применение культивирования с поддержанием рН позволило повысить содержание бифидобактерий примерно до 1 млрд. в 1 мл, а разработка режима отъемно-доливного культивирования с отбором 50% культуральной жидкости позволила значительно повысить продуктивность ферментации. Также показано, что в ходе ферментации вырабатываются молочная и уксусная кислота, обуславливающие подавляющие, как известно из литературы, действие пробиотиков на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. Галофильные микроорганизмы – это одни из немногих известных архей, которые выносят высокие уровни солнечного облучения и высокие концентрации соли в своей естественной среде обитания. При огромном положительном эффекте внедрению галобактерий в массовое производство препятствует ряд факторов. Один из таких факторов – использование дорогостоящих источников питания. При использовании тепловой обработки и ферментного препарата Protosubtilin G3x получены энзиматические гидролизаты на основе пшеницы и ячменя. На этих гидролизатах как источниках протеина и ростовых факторов галобактерии накапливают биомассу и каротиноиды несколько лучше, чем на комплексных субстратах, включающих дорогостоящие триптон, пептон, дрожжевой экстракт. Это можно объяснить ролью высокомолекулярных углеводов, как связующих для метаболитов галобактерий веществ. Показана роль микроэлементов в собственной протеолитической активности галобактерий, которая способствует более полному усвоению белка зерновых и высокому выходу биомассы. Культивирование в ферментере с мембранным модулем на энзиматических гидролизатах пшеницы и ячменя с добавками микроэлементов проходит практически с аналогичными характеристиками. Отмечено меньшее ингибирование роста галобактерий, чем на традиционных комплексных субстратах. Однако при экспериментальных условиях существует предел прироста биомассы, который составляет 45-48 г/л. Причины такого поведения культуры предстоит выяснить в дальнейшем. Сравнение образцов распылительно высушенной биомассы галобактерий, полученных на традиционных комплексных субстратах и на энзиматических гидролизатах зерновых показывает лучшую сохранность клеток и каротеноидов при хранении.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Принято считать, что ключевой стадией биотехнологических процессов является ферментация, поскольку именно на ней происходит образование ценных продуктов. Тем не менее, с точки зрения потребительских свойств не менее важным является сохранение активных компонентов вплоть до их дальнейшего использования или, как минимум, снижение потерь. Известно, что воздействие таких факторов как температура, атмосферная влага, окисление кислородом воздуха является причиной гибели клеток и разрушения биологически активных веществ (БАВ) не только в ходе послеферментационных стадий, но в течение всего времени хранения. Одним из наиболее распространенных способов защиты продуктов ферментации от указанных воздействий является высушивание. Чаще всего в биотехнологии применяют один из двух способов высушивания: распылительная или лиофильная сушка. В первом случае раствор с помощью специального устройства распыляют мельчайшими каплями в поток горячего воздуха, в результате жидкость удаляется и остаются только сухие твердые частицы. При лиофилизации вещество сначала замораживается, а затем помещается в вакуумную камеру, благодаря чему лед превращается в пар, минуя жидкое состояние. Качество консервации зависит не только от того, каким методом ее проводят, но и от конкретных условий эксперимента: температуры, давления и так далее. Поскольку любое высушивание является стрессом для биообъектов, часто используются дополнительные протекторы, что также позволяет снизить потери. Из-за высокой чувствительности пробиотических бактерий, в особенности, бифидобактерий, к кислороду, для их длительной стабилизации применяют, преимущественно, лиофильную сушку. С учетом задач проекта, нами была рассмотрена возможность замены традиционных протекторов животного происхождения (обезжиренное молоко, желатин и т.п.) на растительные. В результате установлено, что использование ферментативного гидролизата пшеничной муки позволяет не только повысить выживаемость клеток бифидобактерий до величины не менее 90 % после лиофилизации, но и дальнейшая их гибель не превышает 10 % в течение 6 месяцев хранения. Результаты в параллелных контрольных опытах, где в качестве протектора использовали обезжиренной молоко, были аналогичными. Таким образом, можно утверждать, что гидролизат муки является полноценной заменой животному сырью. При этом снижаются риски при использовании такой продукции для людей, страдающих аллергиями на молочный белок, непереносимостью лактозы. Не меньший интерес представляет способность длительного, более 1 месяца, сохранения численности живых клеток в культуральной жидкости на основе ферментативного гидролизата муки после ферментации. При этом количество лактобактерий (среди которых – болгарская и ацидофильная палочка, Lactobacillus plantarum и др.) было не ниже 10 в 8 КОЕ/мл после 6 недель хранения, что согласно принятым российским и международным нормативам обеспечивает суточную потребность человека в пробиотикческих микроорганизмах. То есть, получаемую биосуспензию можно рассматривать как ферментированный пробиотический функциональный напиток. Как показали исследования, продукт также обладает хорошими органолептическими показателями, при этом он не содержит белков молока и лактозы, благодаря чему может употребляться людьми с непереносимостью молока. Исследования в данном направлении с целью улучшения потребительских характеристик и качества продукции, а также повышения наукоемкости результатов планируется продолжить. Галофильные микроорганизмы и, в частности, галобактерии продолжают рассматриваться многими исследователями как возможный первый живой организм, занесенный на Землю из просторов космоса и давший, благодаря эволюционным преобразованиям, все разнообразие живых форм на нашей планете. В подтверждение данной гипотезы упоминают более высокую выживаемость клеток микроорганизмов при их высушивании и инкапсуляции, в частности, в кристаллы соли NaCl. Получение и использование высушенных клеток галобактерий дает возможность длительного хранения жизнеспособных клеток, обладающих всеми ценными свойствами, характерными для живой материи вообще. В качестве индикаторов сохранности компонентов биомассы использовали каротиноиды – природные аналоги провитамина А, которые выполняют в галофилах защитную функцию. Для подбора лучших параметров консервации применили модель искусственной нейронной сети, способной обучаться на примере различных условий и различных исходов эксперимента, а затем предсказывать результат для любых заданных входных параметров. Проведена распылительная сушка нескольких образцов биомассы бактерий Halobacterium salinarum, каждый раз изменяя один или несколько параметров: температуру воздушной струи, высушивающей препарат, ее интенсивность и скорость, а также интенсивность распыления биомассы. Эти параметры затем использовали в качестве «входных нейронов» нейросети. «Выходными нейронами» стала концентрация каротиноидов через 4, 6 и 12 месяцев после эксперимента. В результате нейронная сеть подобрала оптимальные параметры распылительной сушки, при которых сохранность каротиноидов максимальная, а повреждения микроорганизмов – минимальные. Результаты работ в текущем году отражены в четырех публикациях в журналах, индексируемых в международных базах Scopus и Web of Science, представлены на международных конференциях в России и за рубежом, а также освещены в прессе (https://www.gazeta.ru/science/news/2018/05/16/n_11540377.shtml?updated).